目前沒有確證 有效的陽性藥物，本單位用細胞模型從市售成藥中篩選有效藥物，發(fā)現(xiàn) PHD1（藥品代號）可以在細胞水平抑制病毒復(fù)制，隨后用小鼠模型進行了藥效學(xué)評價。發(fā)現(xiàn)藥物治療感染小鼠后，臨床癥狀得到改善，病毒復(fù)制被顯著抑制，肺組織病理明顯改善，證明該藥物可治療感染小鼠。

1. 本實驗所用的SARS-CoV-2病毒，在研究所已完成風(fēng)險評估，具有完整的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，全部動物實驗活動在ABSL-3實驗室中進行。

2. 本次申報的新資源“新型冠狀病毒再感染恒河猴模型”在實驗過程中嚴(yán)格遵守研究所生物安全規(guī)章制度和動物實驗規(guī)章制度，遵循SARS-CoV-2病毒風(fēng)險評估和標(biāo)準(zhǔn)操作程序。

3. 感染動物實驗的開展獲得IACUC委員會批準(zhǔn)（IACUC號：BLL20001-8）。

1、臨床指征變化情況：

在整個感染過程中，對體重、體溫等臨床特征進行觀察。如圖2A所示，第一次SARS-CoV-2感染后，超過50%的猴子（4/7，M0、M1、M2和M4）的體重減輕了200至400克，然而所有猴子的直腸溫度均未升高（0/7）。在感染后15天左右，感染猴的體重（M2~ M6）逐漸增加到正常范圍（4/5，M4除外，圖2A），直腸溫度維持在正常范圍內(nèi)（圖2B）。初次感染后，除M4之外，其余6只感染猴觀察到短暫的食欲下降和/或呼吸頻率增加。

在感染后28天，再次感染SARS-CoV-2，猴子表現(xiàn)出短暫的體溫升高，這在初次感染期間是沒有觀察到的。

圖2 新冠病毒再感染恒河猴模型臨床指征的變化情況

2、病毒載量變化情況：

鼻拭子和咽拭子在感染后3天檢測到病毒載量峰值（6.5log10 RNA copies/mL），然后逐漸下降（圖3C和3D）。肛拭子的病毒載量峰值（5log10 RNA copies/mL）低于鼻拭子和咽拭子，也在感染后3天觀察到，然后呈線性下降，在感染后14天降至檢測限之下（圖3E）。在感染后15天左右，所有感染猴的鼻咽拭子和肛拭子的病毒載量均轉(zhuǎn)為陰性。

再次感染SARS-CoV-2后，在鼻咽和肛拭子中病毒載量在2周內(nèi)一直保持為陰性。

圖3 新冠病毒再感染恒河猴模型鼻/咽/肛拭子病毒載量的變化情況

3、血液學(xué)變化情況：

在所有接受初次攻毒的猴子中，白細胞計數(shù)（3.5–9.5× 109/L）、淋巴細胞計數(shù)（LYMP, 1.1–3.4 × 109/L）和中性粒細胞計數(shù)（NEUT,1.8–6.4 × 109/L）均在正常范圍內(nèi)波動。與基線相比，初次感染后感染猴的WBC和LYMP有輕微但顯著的降低（圖4F）。

再次感染SARS-CoV-2后，血液學(xué)檢測未觀察到顯著波動。

圖4 新冠病毒再感染恒河猴模型血常規(guī)變化情況

4、影像學(xué)變化情況：

影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)雙側(cè)膈面模糊，肺部透明度降低，肺左下葉出現(xiàn)小斑影，提示感染猴出現(xiàn)肺炎，表現(xiàn)為中輕度至中度間質(zhì)炎性浸潤。在28dpi時，胸部x光顯示肺部恢復(fù)正常（以M4、M6為代表，圖5G）。

再次感染后，M4、M6感染猴在33dpi（5dpr）影像學(xué)檢測未見異常（圖5G）。

圖5 新冠病毒再感染恒河猴模型影像學(xué)結(jié)果

5、組織分布及病理情況：

對感染猴進行安樂取材，M0（5dpi）和M1（7dpi）中檢測到病毒RNA拷貝，主要集中在鼻（106–108 copies/mL）、咽部（104–106 copies/mL）、肺（103–107 copies/mL）和腸道（104–106 copies/mL）（圖6A）。肺組織進行蘇木精和伊紅（H&E）染色，顯示出輕度至中度間質(zhì)性肺炎，表現(xiàn)為肺泡間隔增寬，肺泡間質(zhì)巨噬細胞和淋巴細胞增多，肺泡上皮變性。此外，初次感染后的猴子肺部發(fā)現(xiàn)了浸潤的炎癥細胞。通過改良的馬松染色， M0（5dpi）和M1（7dpi）感染猴增厚的肺泡間質(zhì)中也可以觀察到膠原纖維（圖6B）。免疫組化發(fā)現(xiàn)病毒主要分布在肺泡上皮和巨噬細胞中（圖6C），證實了SARS-CoV-2導(dǎo)致恒河猴COVID-19。

M3（5dpr）和M5（5dpr）在二次感染后未在組織中檢測到病毒（圖6A），同時肺部病理檢查未見顯著的病變及免疫細胞的炎性浸潤。

圖6新冠病毒再感染恒河猴模型病毒分布和病理變化的比較

6、免疫細胞變化情況：

從外周血中檢測T和B淋巴細胞的亞群,包括CD4 + T細胞亞群（CD4+ T na?ve、CD4+ Tcm、CD4+ Tem）,CD8 + T細胞亞群（CD8+ T na?ve、CD8+ Tcm、CD8+ Tem），記憶B細胞和漿細胞。這些細胞在初次感染及再次感染后均保持穩(wěn)定階段。然而，與0dpi相比，在14dpi時觀察到外周血中活化的CD8+ T細胞的百分比增加，同時在再次感染后（0dpr）也發(fā)現(xiàn)了這一點（圖7A）。對淋巴結(jié)中的免疫細胞進行檢測，再次感染后5天后淋巴結(jié)CD4+ Tcm細胞百分比較初次感染后5天高，CD4+ T na?ve細胞和記憶B細胞百分比下降(圖7B)。

圖7新冠病毒再感染恒河猴模型免疫細胞的變化情況

7、抗體檢測：

由于抗SARS-CoV-2特異性抗體水平逐漸升高，21 dpi時的抗體滴度明顯高于3 dpi時，42 dpi（14 dpr）高于28 dpi（0 dpr）的抗體滴度（圖8C）。此外，特異性抗體滴度在14dpr時遠高于14dpi時（圖8C，右側(cè)）。重要的是，如圖4D所示，中和抗體的平均滴度在再次感染后呈線性增強。

圖8新冠病毒再感染恒河猴模型抗體的變化情況

1、 實驗材料：SARS-CoV-2病毒；選用體重4-6kg的SPF恒河猴。實驗前體檢無異常，所有感染動物必須在ABSL-3實驗室中進行。

2、 氣管途徑SARS-CoV-2再感染恒河猴模型制作方法：每只動物經(jīng)氣管途徑給予1毫升體積，106 TCID50 SARS-CoV-2病毒。待確定動物初次感染建立成功后，持續(xù)監(jiān)測病毒載量和疾病表型，在所有動物疾病恢復(fù)后，即初次感染后28天，再次經(jīng)氣管途徑給予1毫升體積，106 TCID50 SARS-CoV-2病毒，創(chuàng)建新冠病毒再感染恒河猴模型。

3、 樣本收集和檢測：按照以下實驗方案對動物進行監(jiān)測和樣本采集，記錄體重、體溫、臨床體征；采集鼻/咽/肛拭子，測定病毒RNA；采集外周血，檢測血液學(xué)和免疫細胞變化；胸片觀察肺部病變情況；采集血清，進行特異性抗體檢測，并在相應(yīng)時間點進行安樂死和尸檢，檢測病毒組織分布及病理改變。

一、疾病概述

2019冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），是由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起，以重癥肺炎、呼吸衰竭為特征的傳染性疾病。SARS-CoV-2病毒傳染性強，自2019年12月在中國武漢出現(xiàn)后，快速在傳播，引發(fā)大流行。截至2020年11月17日，SARS-CoV-2累計確診感染人數(shù)超5542萬，現(xiàn)有確診人數(shù)超過1580萬人，因COVID-19死亡達133萬人。我國累計報告確診病例92482例，死亡4749例。新型冠狀病毒的傳播嚴(yán)重影響了人們的正常生活，已成為關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會熱點問題，新型冠狀病毒肺炎的防控與治療也是目前研究的熱點。

二、模型背景

1、病原信息

本實驗室分離獲得SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN。它具有高度復(fù)制能力，并且能經(jīng)呼吸道傳播，這些特性使它在研究新型冠狀病毒肺炎的傳播、發(fā)病機制及疫苗和藥物的快速研發(fā)方面具有重要的現(xiàn)實意義。

2、實驗動物背景信息

選用7只體重4-6kg的3-5歲的SPF恒河猴（Maccamulatta）。實驗前體檢無異常，所有感染動物的實驗必須在ABSL-3室中進行。

3、研究背景

新冠肺炎經(jīng)過治療后，部分患者在出院時未檢出SARS-CoV-2，然而在后續(xù)檢測中出現(xiàn)核酸結(jié)果呈陽性。最近，有研究表明在COVID-19發(fā)病后的10-15天內(nèi)能檢測到SARS-CoV-2特異性中和抗體(NAbs)，患者在最初感染痊愈后可能有復(fù)發(fā)或再感染的風(fēng)險，這引起了全世界的關(guān)注。

那么，病人康復(fù)后是否會發(fā)生病毒復(fù)陽？感染新型冠狀病毒后是否會產(chǎn)生特異的抗體？抗體能否保護機體免受再次感染？康復(fù)病人血清內(nèi)的病毒特異性抗體能否用于臨床治療？哪些指標(biāo)可以證明新疫苗的保護作用？為了回答這些問題，我們建立了新冠病毒短期內(nèi)再感染的恒河猴模型。我們利用7只恒河猴進行縱向觀察，在初次SARS-CoV-2感染恢復(fù)后，再利用同一毒株進行再次攻毒。通過再次感染，觀察再感染動物的病毒和免疫特征，以期對新冠肺炎的“復(fù)陽”情況進行研究，為疫苗接種、恢復(fù)期血清治療和疾病預(yù)后提供重要的參考信息。