1 評價標(biāo)準(zhǔn)

（1） 行為學(xué)評價：

① 獎勵性條件反射實驗

鼻觸次數(shù)：動物經(jīng)過訓(xùn)練后形成信號燈亮與獎賞物質(zhì)之間條件反射，屬于巴普洛夫經(jīng)典條件反射范疇，反映了學(xué)習(xí)、理解、推理等方面的認(rèn)知功能。造模成功動物鼻觸次數(shù)顯著降低。

② 水迷宮實驗

逃避潛伏期和總游程：定航能力評價指標(biāo)，反映動物空間參考記憶。造模成功動物逃避潛伏期和總游程顯著增加。

穿臺次數(shù)及目標(biāo)象限游程：探索能力的評價指標(biāo)，反映動物空間參考記憶。造模成功動物穿臺次數(shù)及目標(biāo)象限游程顯著降低。

③穿梭實驗

主動穿梭次數(shù)、被動穿梭次數(shù)、安全區(qū)時間：反映動物聯(lián)想學(xué)習(xí)記憶能力。模型動物主動穿梭次數(shù)和安全區(qū)時間顯著性降低。

（2）分子生物學(xué)評價：

①HPA軸相關(guān)指標(biāo)檢測

皮質(zhì)酮、ACTH兩種激素水平：皮質(zhì)酮和ACTH是由HPA軸釋放的激素，其水平高低反映HPA軸的功能。模型動物皮質(zhì)酮、ACTH兩種激素水平顯著高于正常動物，顯示出HPA軸的亢進。

② 蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

CREB和BDNF蛋白表達(dá)量：與神經(jīng)元細(xì)胞的生長和發(fā)育及突觸可塑性密切相關(guān)。模擬失重組動物海馬CREB和BDNF蛋白表達(dá)量降低，顯示其海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶的損傷。

2 技術(shù)難點

（1）尋找適當(dāng)角度并選擇正確的綁尾方式，保證造模成功的同時盡可能降低對動物機體的損傷。

（2） 建立無人實時監(jiān)控裝置，降低動物的尾吊狀態(tài)未知性，以及時糾正脫落或體態(tài)改變的動物。

3 總結(jié)

經(jīng)過兩周以上的尾部懸吊可誘導(dǎo)大鼠（Wistar大鼠、SD大鼠）學(xué)習(xí)記憶障礙，可作為特因環(huán)境下失重模擬誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶障礙的方法。與其他應(yīng)激方式不同，尾部懸吊針對于航天特因環(huán)境下的應(yīng)激，并很好地模擬了失重效應(yīng)。通過尾部懸吊的方式建立模擬失重記憶障礙模型，發(fā)揮地面模擬實驗的重要作用，為航天特因環(huán)境下，學(xué)習(xí)記憶障礙機理研究、防護和藥物研究提供客觀穩(wěn)定的動物模型，為航天任務(wù)順利進行提供科技支撐。

本實驗采用健康成年SPF級大鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經(jīng)過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進入實驗室，觀察適應(yīng)5天后無異常情況，方進行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1 實驗材料

（1）藥品與試劑：

CORT Elisa試劑盒，ACTH Elisa 試劑盒，均購自美國Rapid BioLab公司。CREB(48H2) rabbit mAb（Cell Signaling）、PCREB (ser133) Antibody（Cell Signaling）、BDNF Antibody (N-20):sc-546（Santa Cruz Bio-technology）、Peroxidase-conjugated goat(anti-mouse)（北京普利萊生物技術(shù)有限公司）、Peroxidase-conjugatedgoat(anti -rabbit)Mouse anti-GAPDH antibody（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、Prestained Protein Ladder(40-300 kDa)（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）

（2）儀器：

①行為學(xué)檢測：大鼠水迷宮實時檢測系統(tǒng)、獎勵性條件反射測試系統(tǒng)(均由北京鑫海華儀公司、中國航天員科研訓(xùn)練中心和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所聯(lián)合研制)

②分子生物學(xué)檢測：電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）、離心機（德國Eppendorf公司）、全自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）、制冰機（意大利Icematic公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、超聲細(xì)胞破碎儀（美國Sonics公司）、TS-1脫色搖床（江蘇海門其林貝樂公司）、雙垂直板電泳槽（美國Bio-Rad公司）、Gel Doc XR凝膠成像（美國Bio-Rad公司）、移液槍（德國Eppendorf公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。

2 評價方法

（1）行為學(xué)評價:

①獎勵性條件反射實驗:

利用獎勵性條件反射測試系統(tǒng)，對造模實驗動物進行檢測。應(yīng)用自由適應(yīng)模式，此模式為信號燈亮，獎賞物質(zhì)給出。以動物探頭次數(shù)（NP）為評價指標(biāo)。動物探頭喝水反應(yīng)了動物對飲水盒的位置記憶與探索興趣程度，此階段訓(xùn)練的目的使動物得到獎賞物質(zhì)可在飲水盒內(nèi)獲得的信息；使動物將信號燈亮與獎賞物質(zhì)之間形成經(jīng)典條件反射。

②水迷宮實驗

空間定航實驗:實驗期間，保持水溫在（23～25）℃，實驗室物品及人員位置固定作為大鼠空間參照物。大鼠先放在位于第三象限內(nèi)的平臺上適應(yīng)15 s，然后分別從第一、二兩個象限放入迷宮中，每次實驗時間為90 s，后適應(yīng)15 s。訓(xùn)練動物找到藏于水面的平臺并爬上平臺。將動物入水到尋臺成功所需時間記作潛伏期。尋臺失敗潛伏期與實驗設(shè)定時間相同。用潛伏期評價動物空間定位學(xué)習(xí)能力。

空間探索實驗:定位航行實驗結(jié)束次日，拆除平臺，選擇第一象限作為入水象限，通過動物在90 s內(nèi)穿過原平臺位置的次數(shù)、原平臺象限游程比率及時間比率（即動物在原平臺象限的游程及時間占總游程及總時間的比率）來評價動物的空間記憶能力。

（2）分子生物學(xué)檢測

①HPA軸相關(guān)指標(biāo)檢測

ELISA試劑盒法。按照試劑盒說明書進行操作，操作步驟如下：試劑盒平衡至室溫（20-25℃）：拿出包被一抗的96孔酶標(biāo)板,并稀釋洗滌液：加入25μL血清標(biāo)本與相應(yīng)反應(yīng)孔中；每空加入200μL酶聯(lián)五，室溫下反應(yīng)60min；甩盡反應(yīng)液，用洗滌液洗板5次；每孔加入顯色液200uL，37℃下反應(yīng)15min；每孔加入終止液100L：15min內(nèi)用酶標(biāo)儀測定450nm處波長的吸光度值。用半對數(shù)做圖法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,由此計算血清中激素濃度。靈敏度：ACTH2.5pg/ml，皮質(zhì)酮0.7nmol/L，批件差10%-15%。

② 蛋白含量檢測

（a）組織蛋白的提取

每組各3個海馬組織，稱重，每10mg組織加入100 μl預(yù)冷的裂解液；冰上超聲破碎，制成10%組織勻漿。再置冰上裂解30 min：將組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管，4℃離心（20min，12000 rpm/min）；取上清液，用BCA法測定蛋白濃度；加4x上樣緩沖液，沸水浴變性5min，快速冷卻，分裝，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

（b）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

配制分離膠。將分離膠注入垂直放置的玻璃板縫隙中，頂層加入1cm高度的異丙醇覆蓋膠面。室溫靜置至凝膠與異丙醇之間有一水平的清晰界面，倒掉異丙醇，用濾紙凝膠頂部液體。CREB選用10%的分離膠，BDNF均選用12%的分離膠。

配制濃縮膠。將配好的濃縮膠注入玻璃板問隙。立即插入齒梳，室溫靜置30 min左右。

電泳。將凝膠插入垂直電泳槽中，小心拔出梳子，加滿電泳緩沖液，往梳孔中加入蛋白分子量marker（3μl/孔）和樣品（8μl/孔）；電壓80 V，當(dāng)溴酚藍(lán)進入分離膠后,將電壓增至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)接近分離膠底部。關(guān)閉電源，取下凝膠，進行轉(zhuǎn)膜。

（c）轉(zhuǎn)膜

按照凝膠大小，剪PVDF膜和兩張Bio-RAD專用濾紙，將剪好的濾紙，海綿墊和夾子在電轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡20min。PVDF膜用甲醇浸泡5min：在轉(zhuǎn)膜夾中，從負(fù)極（黑色）到正極（白色）依次排放：海綿墊—濾紙—凝膠—PVDF膜—濾紙—海綿墊，蓋好正極板，插入電轉(zhuǎn)移槽，倒入電轉(zhuǎn)移液，蓋上蓋；冰浴電轉(zhuǎn)，350mA, 1h。

（d）封閉及抗原抗體反應(yīng)

封閉。電轉(zhuǎn)完畢后，將PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的TBST中，室溫輕搖1h。

孵育一抗。將PVDF膜封入自封袋中，加入一抗稀釋液，將膜完全覆蓋，趕出氣泡，4℃過夜。一抗雜交后用10%TBST洗10 min，每次溫振搖，共3次。

孵育二抗。洗滌后，將PVDF膜封入自封袋中，加入一抗稀釋液，將膜完全覆蓋，趕出氣泡，室溫孵育1h。二抗雜交后用10%TBST洗滌10 min，每次室溫振搖，共３次。

（e）顯色

將A液和B液按1：1比例混勻配制化學(xué)發(fā)光液，避光保存；將膜放于剪好的自封袋中，均勻滴加發(fā)光液，暗處放置3min；置于凝膠電泳顯色儀中照相。

3 評價結(jié)果

（1）行為學(xué)結(jié)果

①獎勵性條件反射實驗

造模14天后從第1天起，與正常組相比，尾吊組鼻觸次數(shù)減少（P＜0.05），尾平組在第2天與正常組形成差異（P＜0.01），尾平組與尾吊組在第3天差異出現(xiàn)顯著性（P＜0.01）；28天時，與正常組和尾平組相比，尾吊組的鼻觸次數(shù)顯著性的減少（P＜0.01），尾平組與正常組間無差異。

圖4 模擬失重對大鼠獎勵性條射鼻觸次數(shù)的影響

注：與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與尾平組比較$P＜0.05，$$P＜0.01。

②水迷宮實驗

對逃避潛伏期的影響：14天時，與正常組和尾平組相比，尾吊組的逃避潛伏期明顯增加，從第2天開始出現(xiàn)差異（P＜0.01），尾吊組與正常組無差異；28天時，尾吊組與正常組和尾平組相比，逃避潛伏期顯著增加，從檢測第1天起，尾吊組與正常組和尾平組一直形成顯著性差異（P＜0.01），形成較穩(wěn)定的顯著性差異，尾平組與正常組無差異。

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與尾平組比較，$P＜0.05，$$P＜0.01。

對總游程的影響：14天時，尾吊組與正常組相比，總游程有明顯的增加，從第3天起差異形成顯著性（P＜0.01），與尾平組相比，從第3天開始出現(xiàn)差異（P＜0.05）并與第4、5天差異形成顯著性（P＜0.01），尾平組與正常組無差異；28天時，尾吊組與正常組和尾平組相比，總游程顯著增加，從第3天起差異出現(xiàn)顯著性（P＜0.01），并形成較穩(wěn)定的差異，尾平組與正常組無差異。

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與尾平組比較，$P＜0.05，$$P＜0.01。

同時，采用穿梭實驗檢測發(fā)現(xiàn)，尾吊動物的聯(lián)想學(xué)習(xí)記憶能力降低（14天造模后），表現(xiàn)在主動穿梭次數(shù)、安全區(qū)時間等指標(biāo)上。

（2）分子生物學(xué)檢測

①HPA軸相關(guān)指標(biāo)檢測

與正常組相比，尾吊顯著性地增加了血清中皮質(zhì)酮和ACTH的含量（P＜0.01），可引起下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（HPA軸）功能亢進。

注：與正常組比較，**P＜0.01。

② 蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

以GAPDH為標(biāo)準(zhǔn),與正常組相比，尾吊組CREB和BDNF的表達(dá)量顯著減少（P＜0.01）。

1模擬失重實時監(jiān)控裝置的建立

裝置由多個箱體單元組成，每一個箱體單元包括至少一個尾吊籠，尾吊籠設(shè)置在箱體單元內(nèi)，用于提供動物尾部懸吊實驗的空間；每一個箱體單元的上方安裝有攝像裝置，用于獲取箱體單元中動物模擬失重尾部懸吊實驗時的長期、動態(tài)、連續(xù)、實時的自發(fā)活動圖像信息；每一個尾吊籠的上方安裝有懸吊裝置，用于與動物尾部連接；每一個尾吊籠上方安裝有脫落檢測裝置，用于在動物尾部懸吊實驗時，檢測動物尾部懸吊是否脫落，且在檢測到動物尾部脫落時，向計算機系統(tǒng)發(fā)出報警信號；以及計算機系統(tǒng)，用于接收攝像裝置發(fā)送的圖像信息和所述脫落檢測裝置發(fā)送的報警信號，并將報警信號發(fā)送給指定的實驗人員。

與以往尾吊籠相比，此次的模擬失重裝置具有以下特點：

（1）箱體單元包括至少一個尾吊籠，實現(xiàn)一個攝像裝置同步對箱體單元中的至少一個尾吊籠中的動物的自主活動進行實時監(jiān)控及圖像提取，而且還可在攝像裝置的鏡頭之前設(shè)置紅外透鏡，通過該紅外透鏡濾除其他光線的干擾，提高圖像的信噪比。

（2）可通過脫落檢測裝置檢測動物尾部懸吊是否脫落，通過計算機系統(tǒng)將報警信號發(fā)送給指定的實驗人員，實現(xiàn)脫落報警，使得實驗人員可及時進行實驗干預(yù)。

（3）通過在尾吊籠外側(cè)面設(shè)置雙瓶飲水裝置，可為動物的糖水偏愛實驗檢測提供條件，實現(xiàn)對抑郁或類抑郁行為的檢測。

（4）箱體單元中的尾吊籠之間可設(shè)置活動隔板層，實現(xiàn)動物的交流受阻隔離狀態(tài)和非隔離狀態(tài)的互換。

總而言之，本裝置的建立充分考慮到了動物模型多樣本量、時間長、人工觀察工作量大，脫落預(yù)處理不及時等因素，可實現(xiàn)對尾部懸吊的動物的自主活動的實時監(jiān)測、脫落報警以及為抑郁或類抑郁行為檢測提供條件。同時提供了路程、速度、時間三個指標(biāo)，運動與靜息兩種狀態(tài)的分時、分段、分區(qū)等數(shù)據(jù)，以及動物的尾部懸吊的狀態(tài)等信息，能實時獲取、保存和輸出動物的實時活動圖像，從而確保了實驗的穩(wěn)定性、可靠性。

注：11：箱體單元；12：尾吊籠；13：攝像裝置；14：脫落檢測裝置；15：食物盒；16：雙瓶飲水裝置；17：發(fā)光二極管；18：活動隔板層；19：柵網(wǎng)；20：廢物收集盒；21：多路圖像卡；22：實驗軟件；23：接口卡；24：傳輸接口；31：脫落檢測單元；32：消息收發(fā)單元。

2模型的誘導(dǎo)方法

（1）動物：SPF級，Wistar大鼠、SD大鼠（200±10 g），雄性

（2）材料：醫(yī)用橡皮膏、帆布手套、傷濕止痛膏

（3）儀器：動物模擬失重尾部懸吊實時監(jiān)測裝置(均由北京鑫海華儀公司、中國航天員科研訓(xùn)練中心和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所聯(lián)合研制)

（4）誘導(dǎo)過程：大鼠尾吊采用動物模擬失重尾部懸吊實時監(jiān)測裝置進行，每個箱體尺寸為26㎝×26㎝×30㎝。尾吊方法簡述如下：使大鼠鉆入帆布手套，僅使其尾部外露。將傷濕止痛膏剪成約長7cm，寬約1cm的長條狀，將其中間段1/3長度延長軸方向?qū)ΟB，兩頭端1/3處粘在大鼠距尾根部約1cm處，使其成一個環(huán)形結(jié)構(gòu)，將醫(yī)用橡皮膏螺旋形包裹在其外部，避免滑脫。將一頭帶鉤的金屬鏈條鉤住環(huán)狀膏藥，另一頭穿過尾吊儀微動開關(guān)的環(huán)形掛圈，根據(jù)需要調(diào)節(jié)鏈條長度，并用金屬夾將鏈條固定，使動物軀干與尾吊籠底部約成-30°角，使大鼠借助前肢可在尾吊籠內(nèi)360°自由活動和自由飲食飲水。行為學(xué)檢測期間應(yīng)保持大鼠處于造模時的尾吊狀態(tài)，在行為學(xué)檢測時應(yīng)盡量減少動物的非尾吊時間，取下后及時檢測，檢測完后及時恢復(fù)尾吊。

隨著我國在載人航天工程事業(yè)取得重大成功，空間站工程也正式啟動。空間站工程要求航天員必須具備較長時間的連續(xù)在軌駐留能力，必須克服長時間航天飛行因受到失重、晝夜節(jié)律改變、狹小密閉環(huán)境等多種因素影響所導(dǎo)致的一系列諸如心血管功能障礙、失重骨丟失、肌肉萎縮、免疫功能下降等失重生理效應(yīng)。同時，航天環(huán)境可造成認(rèn)知功能及反應(yīng)判斷能力下降，直接影響航天員對信息處理可靠性，甚至造成重大操作失誤，對航天工作帶來的危害則難以估量［1-3］。

在受科學(xué)技術(shù)、經(jīng)費等限制，航天飛行難以長期、重復(fù)進行，地面模擬失重的實驗方法的建立就顯得尤為重要。Darren M. Lipnicki 等分析了25例健康男性受試者在60天頭低位臥床前及臥床期間（第51天）LGT的行為表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)臥床前及期間受試者的決策能力明顯改變[4]。MesserottiBenvenuti 等將22 名男性受試者隨機分為對照組及頭低位臥床組，3小時后對受試者進行圖片觀察任務(wù)測試，結(jié)果表明頭低位臥床會明顯影響了受試者的學(xué)習(xí)能力[5]。使用功能性磁共振fMRI方法測試結(jié)果表明失重狀態(tài)時，興奮腦區(qū)的激活范圍和強度有明顯的減少[6]。吳大蔚等觀察了尾部懸吊模擬微重力對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，發(fā)現(xiàn)尾吊7d及12d小鼠空間記憶能力降低[7]。

實驗動物在地面模擬失重的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。對于動物實驗，起初是采用全身或局部限動的方法模擬失重狀態(tài)下的低活動度，逐漸發(fā)展到采用頭低位的方法模擬失重環(huán)境下的血液頭向分布生理學(xué)效應(yīng)[8]。頭低位尾部懸吊模擬失重應(yīng)激程度較輕，可長時間模擬失重狀態(tài)。該模型的研究可為航天等特因環(huán)境下，學(xué)習(xí)記憶障礙機理研究、防護和藥物研究提供實驗基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Li S, Wang C,Wang MW, et al. Impairment of the spatial learning and memory induced bylearned helplessness and chronic mild stress[J]. Pharmacology Biochemistry andBehavior, 2006, 83(2):186-193.

[2] McTeague LM, LangPJ. The anxiety spectrum and the reflex physiology of defense: fromcircumscribed fear to broad distress[J]. Depress Anxiety, 2012, 29:264-281.

[3] Conrad CD. Acritical review of chronic stress effects on spatial learning and memory[J]. ProgrNeuro-Psychopharmacol Biol Psychiat, 2010, 34:742-755.

[4]Lipnicki, DM, Gunga, HC, Belavy, DL, dFelsenberg, D. Decision making after 50days of simulated weightlessness [J]. Brain research, 2009, 1280: 84-89.

[5] MesserottiBenvenuti, S, Bianchin, M, and Angrilli, A. Effects of simulated microgravityon brain plasticity: A startle reflex habituation study [J]. Physiology &behavior, 2011, 104:503-506.

[6] 劉剛, 金真, 李科, 曾亞偉, 李勇枝. 模擬失重狀態(tài)對人腦認(rèn)知功能的影響 [J]. 中華航空航天醫(yī)學(xué)雜志,2005,16(3): 161-164.

[7] 吳大蔚, 沈羨云, 董頎, 等. 尾部懸吊對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 [J]. 航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程. 2000,13(4): 244-248.

[8] 董麗, 王瓊, 劉新民, 楊思進.地面模擬失重實驗方法概況[J].中國實驗動物學(xué)報, 2013,21(05): 90-94.