一、無菌操作要求

1. 接種細菌時必需穿任務(wù)服、戴任務(wù)帽。

2. 停止接種食品樣品時，必需穿公用的任務(wù)服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無菌室緩沖間，任務(wù)前經(jīng)紫外線消毒后運用。

3. 接種食品樣品時，應(yīng)在進無菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球?qū)⑹植翝崈?/b>。

4. 停止接種所用的吸管，平皿及培育基等必需經(jīng)消毒滅菌，翻開包裝未運用完的器皿，不能放置后再運用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精撲滅炙烤三次后運用。

5. 從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，運用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。

6. 接種樣品、轉(zhuǎn)種細菌必需在酒精燈前操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取出后及翻開試管塞都要經(jīng)過火焰消毒。

7. 接種環(huán)和針在接種細菌前應(yīng)經(jīng)火焰炙烤全部金屬絲，必要時還要燒到環(huán)和針與桿的銜接處，接種結(jié)核菌和烈性菌的接種環(huán)應(yīng)在沸水中煮沸5min，再經(jīng)火焰炙烤。

8. 吸管吸取菌液或樣品時，運用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。

二、無菌間運用要求

1. 無菌間通向外面的窗戶應(yīng)為雙層玻璃，并要密封，不得隨意翻開并設(shè)有與無菌間大小相應(yīng)的緩沖間及推拉門，另設(shè)有0.5~0.7m2的小窗，以備進入無菌間后傳遞物品。

2. 無菌間內(nèi)應(yīng)堅持清潔，任務(wù)后用2%~3%煤酚皂溶液消毒，擦拭任務(wù)臺面，不得寄存與實驗有關(guān)的物品。

3. 無菌間運用前后應(yīng)將門關(guān)緊，翻開紫外燈，如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時間不少于30min，運用紫外燈，應(yīng)留意不得直接在紫外線下操作，以免惹起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球悄然擦拭，除去下面灰塵和油垢，以增加紫外線穿透的影響。

4. 處置和接種食品標本時，進入無菌間操作，不得隨意出入，如需求傳遞物品，可經(jīng)過小窗傳遞。

5. 在無菌間內(nèi)如需求裝置空調(diào)時，則應(yīng)有過濾裝置。

三、消毒滅菌要求

微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培育基、被污染和接種的培育物等，必需經(jīng)滅菌前方能運用。干熱和干冷高壓蒸氣鍋滅菌方法。

1.滅菌前預(yù)備 （1）一切需求滅菌的物品首先應(yīng)清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴密，如用金屬筒應(yīng)將下面通氣孔翻開。 （2）裝培育基的三角瓶塞，用紙包好，試管蓋好蓋，注射器須將管芯抽出，用紗布包好。

2.裝放 （1）干熱滅菌器：裝放物品不可過擠且不能接觸箱的四壁。 （2）大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品區(qū)分包扎好，直接放入消毒筒內(nèi)，物品之間不能過擠。

3.設(shè)備反省 （1）反省門的開關(guān)能否靈敏，橡皮圈有無損壞，能否平整。 （2）反省壓力表蒸氣排盡時能否停留在零位，關(guān)好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察能否漏氣，壓力表與溫度計所標示的狀況能否吻合，管道有無梗塞。 （3）對有自動電子順序控制裝置的滅菌器，運用前應(yīng)反省規(guī)則的順序，能否契合于停止滅菌處置的要求。

4.滅菌處置

(1)干熱滅菌法： 此法順應(yīng)于在干熱狀況下，不損壞、不蛻變、不蒸發(fā)的物品、較常用于玻璃器皿、金屬制品、陶瓷制品等的滅菌。 ① 器械器皿應(yīng)清洗后再干烤，以防附著在外表的污物炭化。 ② 滅菌時安放物品不能過擠，不要直接接觸底和箱壁，物品之間留有空隙。 ③ 滅菌時將箱門關(guān)緊，接上電源，先將排氣孔翻開約30min，掃除滅菌器中的冷空氣，溫度升至160℃調(diào)理指示燈，維持1.5~2h。 ④ 滅菌終了后或溫度升溫進程中，須在60℃以下才干翻開箱門。

(2)手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的運用應(yīng)按下列步驟停止： ① 手提式高壓鍋在主體內(nèi)參與3L清水，立式高壓鍋加水16L（重復(fù)運用時應(yīng)將水量補足，水變混濁需改換）； ② 手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管拔出消毒桶內(nèi)壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕分裂的滅菌器不得運用）； ③ 蓋好頂蓋擰緊，勿使漏氣；置滅菌器于火源上加熱，立式壓力鍋通上電源，并翻開頂蓋上的排氣閥放了冷氣（水沸騰后排氣10~15min）； ④ 封鎖排氣閥，使蒸氣壓上升到規(guī)則要求，并維持規(guī)則時間（按滅菌物品性質(zhì)與有關(guān)狀況而定）； ⑤ 到達規(guī)則時間后，對需枯燥的物品，立刻翻開排氣閥排出蒸氣，待壓力恢復(fù)到零時，自然冷卻至60℃后開蓋取物，如為液體物品，不要翻開排氣閥，而應(yīng)立刻將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復(fù)至零，溫度降到60℃以下，再開蓋取物，以防突然減壓液體猛烈沸騰或容器爆破。

(3)臥式壓力鍋蒸氣滅菌器的運用按下列步驟停止： ① 關(guān)緊鍋門，翻開進氣閥，將蒸氣引入夾層停止預(yù)熱，夾層內(nèi)冷空氣經(jīng)阻氣器自動排出； ② 夾層到達預(yù)定溫度后，翻開鍋室進氣閥，將蒸氣引入鍋室，鍋室內(nèi)冷空氣經(jīng)鍋室阻氣器自動排出； ③ 待鍋室到達規(guī)則的壓力與溫度時，調(diào)理進氣閥，使堅持恒定； ④ 自然或人工降溫至60℃再開門取物，不得運用快速排出蒸氣法，以防突然降壓，液體猛烈沸騰或容器爆破； ⑤ 運用自動順序控制式壓力蒸氣滅菌器，在放好物品關(guān)緊門后，應(yīng)依據(jù)物品類別按動相應(yīng)開關(guān)，以便按要求順序自動停止滅菌，滅菌時必需應(yīng)用附設(shè)儀表記載溫度與時間以備查，操作要求應(yīng)嚴厲依照廠家說明書停止；

5.滅菌溫度與時間 (1) 干熱滅菌器滅菌溫度160℃，1.5~2h。 (2) 壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時間

四、間歇滅菌方法

1.滅菌方法： 應(yīng)用不加壓力的蒸氣滅菌，某些物質(zhì)經(jīng)高壓蒸氣滅菌容易破壞，可用此法滅菌。 （1）將欲滅菌物品置于鍋內(nèi)，蓋上頂蓋，翻開排水口，使器內(nèi)余水排盡。 （2）封鎖排水口，翻開進氣門，依據(jù)需求消毒10~20min。 （3）滅菌終了封鎖進氣門，取出物品待冷至室溫溫度，放入37℃溫箱過夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可到達滅菌目的。

2.血清凝結(jié)器運用方法: 培育基中含有血清或雞蛋特殊成份時，因高熱會破壞其營養(yǎng)成份，故用高溫，可使血清凝結(jié)，又可到達滅菌目的： （1）在運用該法滅菌的血清等分裝時，需嚴厲遵守無菌操作，試管、平皿也經(jīng)滅菌后運用； （2）將培育基按要求使成斜面或高層，加足水后，接上電源，升溫75~90℃一小時后滅菌，放37℃溫箱過夜，再如此滅菌三次。

3.煮沸消毒： 可用煮鍋或煮沸消毒器，水沸騰后再煮5~15 min，也可在水中參與2%石炭酸煮沸5min，參與0.02%甲醛，80℃煮60min均可到達滅菌目的，但選用煮沸消毒的增消劑時，應(yīng)留意對物品的腐蝕性。

4.滅菌處置: 滅菌后物品，按正常狀況已屬無菌，從滅菌器中取出應(yīng)細心反省放置，以免再度污染； （1）物品取出，隨即反省包裝的完整性，若有破壞或棉塞脫掉，不可作為無菌物品運用； （2）取出的物品，如為包裝有清楚的水浸者，不可作為無菌物品運用； （3）培育基或試劑等，應(yīng)反省能否契合到達滅菌后的色澤或形狀，未到達者應(yīng)廢棄； （4）啟閉式容器，在取出時應(yīng)將篩孔封鎖； （5）取出的物品掉落在地或誤放不潔處,或沾有水液,均視為遭到污染,不可作為無菌物品運用； （6）取出的合格滅菌物品，應(yīng)寄存于貯藏室或防塵柜內(nèi)，嚴禁與未滅菌物品混放； （7）凡屬合格物品，應(yīng)標有滅菌日期及有效期限； （8）每批滅菌處置完成后，記載滅菌品名、數(shù)量、溫度、時間、操作者。

五、有毒有菌污物處置要求

微生物實驗所用實驗器材、培育物等未經(jīng)消毒處置，一概不得帶出實驗室。

1. 經(jīng)培育的污染資料及廢棄物應(yīng)放在嚴密的容器或鐵絲筐內(nèi)，并集中寄存在指定地點，待一致停止高壓滅菌。

2. 經(jīng)微生物污染的培育物，必需經(jīng)121℃，30min高壓滅菌。

3. 染菌后的吸管，運用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，*少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經(jīng)121℃，30min高壓滅菌。

4. 涂片染色沖洗片的液體，普通可直接沖入下水道，烈性菌的沖洗液必需沖在燒杯中，經(jīng)高壓滅菌前方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗濯。做凝集實驗用的玻片或平皿，必需高壓滅菌后洗濯。

5. 打碎的培育物，立刻用5%煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭潔凈。

污染的任務(wù)服或停止烈性實驗所穿的任務(wù)服、帽、口罩等，應(yīng)放入公用消毒袋內(nèi)，經(jīng)高壓滅菌前方能洗濯。

六、培育基制備要求

培育基制備的質(zhì)量將直接影響微生物生長，由于，各種微生物對其營養(yǎng)要求不完全相反，培育目的的不同，各種培育基制備要求如下：

1. 依據(jù)培育基配方的成分按量稱取，然后溶于蒸餾水中，在運用前對運用的試劑藥品應(yīng)停止質(zhì)量檢驗。

2. pH測定及調(diào)理：pH測定要在培育基冷至室溫時停止，因在熱或冷的狀況下，其pH有一定差異，當測定好時，按計算量參與堿或酸混勻后，應(yīng)再測試一次。培育基pH值一定要準確，否則會影響微生物的生長或影響結(jié)果的觀察。但需留意因高壓滅菌可影響一些培育基的pH降低或降低，故不宜滅菌壓力過高或次數(shù)太多，以免影響培育基的質(zhì)量，指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等普通在調(diào)完pH后再參與。

3. 培育基需堅持廓清，便于觀察細菌的生長狀況，培育基加熱煮沸后，可用脫脂棉花或絨布過濾，以除去沉淀物，必要時可用雞蛋白廓清處置，所用瓊脂條要預(yù)先洗凈晾干后運用，防止因瓊脂含雜質(zhì)而影響透明度。

4. 盛裝培育基不宜用鐵、銅等容器，運用洗凈的中性硬質(zhì)玻璃容器為好。

5. 培育基的滅菌既要到達完全滅菌目的，又要留意不因加熱而降低其營養(yǎng)價值，普通121℃，15min即可，如為含有不耐高熱物質(zhì)的培育基如糖類、血清、明膠等，則應(yīng)采用高溫滅菌或間歇法滅菌，一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等，待基礎(chǔ)瓊脂高壓滅菌后涼至50℃左右再參與；

6. 每批培育基制備好后，應(yīng)做無菌生長實驗及所檢菌株生長實驗。假設(shè)是生化培育基，運用規(guī)范菌株接種培育，觀察生化反響結(jié)果，應(yīng)呈正常反響，培育基不應(yīng)貯存過久，必要時可置4℃冰箱寄存。

7. 目前，各種枯燥培育基較多，每批需用規(guī)范菌株停止生長實驗或生化反響觀察，各種培育基用相應(yīng)菌株生長實驗良好前方可運用，新購進的或寄存過久的枯燥培育基，在配制時也應(yīng)測pH，運用時需依據(jù)產(chǎn)品說明書用量和方法停止。

8. 每批制備的培育基所用化學試劑、滅菌狀況及菌株生長實驗結(jié)果、制造人員等應(yīng)做好記載，以備查詢。

七、樣品采集及處置要求

1.所采集的檢驗樣品一定要具有代表性，采樣時應(yīng)首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等停止詳細調(diào)查，反省能否有污染源存在。

2.依據(jù)食品的種類及數(shù)量，采樣數(shù)量及方法應(yīng)按規(guī)范檢驗方法的要求停止。

3.采樣應(yīng)留意無菌操作，容器必需滅菌，防止環(huán)境中微生物污染，容器不得運用煤酚皂溶液，用新潔爾滅、酒精等消毒藥物滅菌，更不能含有此類消毒藥物或抗生素類藥物，以防止殺死樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可運用。

4.樣品采集后應(yīng)立刻送往檢驗室停止檢驗，送檢進程中普通不超越3h，如，路程較遠，可保管在1~5℃環(huán)境中，如需冷凍者，則在凍存形狀下送檢。

5.檢驗室收到樣品后，停止注銷（樣品稱號、送檢單位、數(shù)量、日期、編號等），觀察樣品的外觀，假設(shè)發(fā)現(xiàn)有下列狀況之一者，可拒絕檢驗： (1)樣品經(jīng)過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者，失掉代表原食品檢驗意義者； (2)瓶、袋裝食品已啟開者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失掉原食品外形者（食物中毒樣品除外）； (3)按規(guī)則采樣數(shù)量缺乏者； 對送檢契合要求的樣品，檢驗室收到后，應(yīng)立刻停止檢驗，假設(shè)條件不具有，應(yīng)置4℃冰箱寄存，及時預(yù)備發(fā)明條件，然后停止檢驗。

6.樣品檢驗時，依據(jù)其不異性狀，停止適當處置。 (1)液體樣品接種時，應(yīng)充沛混合平均，按量吸取停止接種。 (2)固體樣品，用滅菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225mL滅菌生理鹽水或其他溶液中，用均質(zhì)器攪碎混勻后，按量吸取接種。 (3)瓶、袋裝食品運用滅菌操作啟開，依據(jù)性狀選擇上述方法處置后接種。

八、 樣品檢驗、記載和報告的要求

1. 檢驗室收到樣品后，首先停止外觀檢驗，及時依照國度規(guī)范檢驗方法停止檢驗，檢驗進程中要仔細、擔任、嚴厲停止無菌操作，防止環(huán)境中微生物污染。

2. 樣品檢驗進程中所用方法、出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果等均要用文字寫出實驗記載，以作為對結(jié)果剖析、判定的依據(jù)，記載要求詳細、清楚、真實、客觀、不得涂改和偽造。

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