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H7N9氣溶膠吸入感染雪貂模型

健明迪檢測提供的H7N9氣溶膠吸入感染雪貂模型,討論與結(jié)論 到目前為止,已經(jīng)報道有2種非人靈長類動物(恒河猴、食蟹猴)和4種嚙齒類動物(大鼠、小鼠、田鼠、沙鼠),具有CMA,CNAS認證資質(zhì)。
H7N9氣溶膠吸入感染雪貂模型
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討論與結(jié)論

到目前為止,已經(jīng)報道有2種非人靈長類動物(恒河猴、食蟹猴)和4種嚙齒類動物(大鼠、小鼠、田鼠、沙鼠),雪貂、家貓以及雞、鴨等禽類可以作為H5N1禽流感病毒動物模型用于實驗研究。低致病性H5N1禽流感病毒可以通過適應建立鼠肺適應株感染小鼠建立小鼠模型。非人靈長類動物通過鼻腔吸入較難感染,通常需要借助輔助器材進行定位感染,動物感染后體征變化不顯著,肺組織出現(xiàn)局灶性病變。

前期研究顯示雪貂的受體分布情況與人極為接近,呼吸氣道長,上下呼吸道分腔明顯是流感病毒研究最為理想的動物模型,缺點是雪貂受物種特異性限制缺乏相應的檢測試劑。小鼠對多種流感病毒敏感,一直被選擇作為流感病毒研究的動物模型,不僅有完備的檢測試劑,還有相應的基因敲除、轉(zhuǎn)基因小鼠可用于機制方面的研究。早期研究曾在多種非人靈長類動物中(非洲綠猴、Pata猴、豬尾猴、食蟹猴)檢測到血清抗體陽性,并推測猴群感染病毒參與了流感大流行。研究發(fā)現(xiàn)非人靈長類動物感染禽流感病毒后的臨床改變、病理變化、抗原分布都與人類存在一定差異,研究結(jié)果顯示其對流感病毒敏感性較雪貂、小鼠低。至今沒有直接證據(jù)表明非人靈長類動物的受體分布情況與人接近。恒河猴中研究局部肺組織損傷機制不僅與巨噬細胞有關,在研究抗補體機制中還應考慮PAMP的參與,NF-κB 等炎癥信號途徑的作用,這些研究在非人靈長類中受到一定限制,目前小鼠可以提供多方面抗補體機制研究。

受體比較

1) 人呼吸道上皮受體分布情況:α-2,6連接唾液酸糖蛋白受體主要分布在鼻粘膜上皮細胞, α-2,3連接唾液酸糖蛋白受體分布在鼻旁竇、咽、氣管、細支氣管上皮上。在終端呼吸性細支氣管上皮細胞也表達α-2,6連接唾液酸糖蛋白受體。α-2,3連接唾液酸糖蛋白受體出現(xiàn)在呼吸細支氣管與肺泡交界的無纖毛立方細支氣管細胞上,部分肺泡壁細胞表達這種受體,這種細胞為肺泡Ⅱ型細胞。病人感染H5N1禽流感病毒后,病毒主要分布在肺泡Ⅱ型細胞內(nèi)。

2) 雪貂除了氣管中極少數(shù)杯狀細胞既表達α-2,3SA受體又α-2,6SA受體,其上下呼吸道受體分布與人極為相似,小鼠多表達α-2,3SA受體,α-2,6SA受體較少,曾局限的認為小鼠較適合用于α-2,3SA受體結(jié)合的病毒研究,后有研究發(fā)現(xiàn)受體特異性并不影響某些病毒對小鼠的致病力和復制能力。

3)有研究顯示通過體外實驗證實非洲綠猴上皮細胞與人類流感病毒和禽類流感病毒都有較好的結(jié)合能力,與人類上皮細胞的結(jié)合能力接近。缺乏實驗證據(jù)顯示其受體與人類受體分布相似度。

6.2感染途徑比較

1) 小鼠、雪貂通過輕微麻醉后,以吸入式方式感染,感染方式與人極為接近。

2) 恒河猴、綠猴、食蟹猴等需要以環(huán)甲膜穿刺、支氣管鏡定位感染等方式進行感染,感染途徑與自然感染途徑差別較大,感染效果通常會出現(xiàn)肺組織局域性灶狀感染,與吸入性感染方式產(chǎn)生的病變程度、范圍存在一定差別。

感染后癥狀

1) 部分禽流感病毒在猴上皮細胞中復制受限或者發(fā)生不同程度的衰減。例如禽來源的H2N2病毒不能感染猴,H5N1高致病性禽流感病毒需要以高出雪貂感染劑量103倍的劑量感染猴,仍不致死,僅產(chǎn)生一過性體溫升高。

2) 幾乎所有禽流感病毒都能夠在雪貂中成功復制,并產(chǎn)生臨床可觀察的改變,例如體溫升高、體重下降、噴嚏、流涕、精神萎靡甚至死亡。

3)H5N1禽流感病毒感染小鼠后出現(xiàn)嚴重的肺炎,除呼吸道以外還在腦、脾、肝等組織中發(fā)現(xiàn)病毒抗原,并在腦組織中出病理改變,猴感染后在呼吸道以外的組織中未發(fā)現(xiàn)病毒抗原。

生物安全性

CRP基因敲除小鼠和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠在賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司模式動物研究中心完成,該中心具有符合國際標準的動物模型制備相關完備監(jiān)督管理制度。動物的繁殖及感染模型評估在中國疾控中心動物中心完成,所有操作在SFP級別下遵守二級生物安全管理規(guī)定進行,實驗動物尸體實行無害化處理,對生態(tài)環(huán)境無影響。

評價驗證

1. 雪貂模型感染后臨床癥狀變化

雪貂在實驗前1周測正常體溫和體重,確定正常值,感染組雪貂在H7N9病毒接種的第1~2天使體溫升高,體溫升高0.5~2℃,體溫升高持續(xù)3天左右,臨床無死亡現(xiàn)象。雪貂感染后出現(xiàn)流涕、打噴嚏、呼吸困難、攝食減少、精神萎靡、活動度下降,對外界刺激無反應等臨床表現(xiàn)。傳播組雪貂在合籠后第11天開始出現(xiàn)較明顯的體重下降,體溫無明顯變化,有雪貂出現(xiàn)流涕、噴嚏的現(xiàn)象。

圖1 H7N9感染與傳播組雪貂體重變化率、體溫變化情況

圖2H7N9感染與傳播組雪貂臨床評分

2. 雪貂模型感染后病毒在組織中復制情況

病毒感染雪貂后第1天到第5天,用RT-qPCR方法可從鼻甲骨活檢物(鼻拭子)中檢測到病毒載量。從雪貂的鼻甲骨標本、肺組織標本中,經(jīng)MDCK細胞培養(yǎng),接種細胞產(chǎn)生典型細胞病變(CPE),提示病毒感染了雪貂并由病毒的復制和排毒,鼻甲骨標本分離陽性的高峰期在1~5天。傳播組1/3雪貂合籠后5-7天在鼻拭子中檢測到病毒。感染組解剖雪貂可在鼻甲、氣管、肺、腎、腸、眼組織中分離到活病毒,此結(jié)果證明H7N9病毒可以在呼吸道以外的組織氣管中復制、繁殖。用HA方法可證實MDCK細胞有H7N9抗原存在。

圖3 H7N9感染與傳播組雪貂鼻拭子病毒滴度

3. 雪貂模型感染后血清特異性抗體產(chǎn)生情況

在H7N9病毒接種前和接種后第5天安樂時,經(jīng)靜脈采血1mL分離血清,檢測血清中H7N9病毒特異性抗體。感染組雪貂在5天安樂死時,均為陰性;在21天取血時,均為陽性。傳播組雪貂在合籠第21天血清中抗體檢測為陽性。

表1 H7N9感染與傳播組雪貂血清抗體水平

Table 1 The antibody level of H7N9 infected and exposed ferrets

制備方法

雪貂呼吸道解剖結(jié)構(gòu)上下呼吸道分腔明顯,受體分布與人極為接近,是迄今為止最為敏感的流感病毒感染動物模型。它對人流感病毒高度易感,病毒不經(jīng)適應即能使雪貂致病,并易傳播給雪貂和人。在自然條件下,雪貂一般也是通過呼吸道吸入病毒的方式感染流感病毒,其感染后的發(fā)病過程和機體反應也與人體相似。雪貂除對人流感病毒高度易感外,對禽流感、豬流感病毒也十分敏感,且感染后出現(xiàn)典型癥狀。

分子生物學研究顯示,這是由于雪貂的呼吸道上皮細胞表面存在人流感病毒特異性受體α2,6糖鍵連接的唾液酸,而其肺泡上皮細胞表面也存在著禽流感病毒特異性受體α2,3糖鍵連接的唾液酸。

概括起來,相較于其他流感動物模型,雪貂的優(yōu)勢為 :(1)雪貂感染流感病毒后的癥狀、發(fā)病機制和免疫反應與人類極為相似。(2)人甲、乙型流感病毒均可自然感染雪貂,這為在完全控制的群體內(nèi)觀察流感的傳播規(guī)律和流感病毒抗原性的漂移和轉(zhuǎn)變提供了可能。(3)雪貂的氣管較長,這樣就使其上、下呼吸道區(qū)室化,有利于研究流感病毒對呼吸道不同區(qū)域的效應差異。(4)雪貂作為動物模型比嚙齒類大,易于監(jiān)測其體溫、脈搏和呼吸頻率。(5)在小型動物中,雪貂是唯一感染甲型流感病毒后自然出現(xiàn)發(fā)熱反應的動物模型。基于此,目前雪貂作為理想的流感動物模型已被廣泛應用于流感發(fā)病機理等各方面的研究,為人類流感研究做出了重要貢獻。

去勢雪貂(Mustela Pulourius Furo),4-10月齡,500-1000克。實驗前進行血清學檢查,HI方法檢測血清H7N9、H1N1、H5N1抗體,抗體陰性為合格雪貂方可入組實驗。

病毒株為A/Anhui/1/2013 (H7N9),經(jīng)血凝抑制(HI)實驗,篩選出6月齡以下對當下流行的H1N1、H3N2、H5N1、H7N9亞型流感病毒相應血清抗體均為陰性的去勢雪貂。為了使動物適應并降低應激反應,所有雪貂均在感染前一周進行體溫芯片的皮下植入和實驗室適應(使用掃描儀監(jiān)測體溫,BMDS, USA)。感染組通過肌肉注射鹽酸塞拉嗪對雪貂進行麻醉,輕度麻醉后感染組每只雪貂經(jīng)鼻接種病毒。在感染組旁邊設置傳播組,感染組在感染24小時后放入傳播籠中傳播組的鄰近籠。感染組和傳播組于感染(合籠)后第0-14天連續(xù)測量體溫、體重并記錄臨床癥狀以進行評分;在接種(合籠)病毒1d后,每天收集鼻甲骨活檢物(鼻拭子)標本,進行病毒分離和載量測定;感染后第5天感染雪貂安樂處死,尸檢時取肺、氣管、肝、脾、腦、腸、心和腎組織,進行病毒滴度測定和組織病理學檢查。

研究背景

2013 年3月31日,依據(jù)《國際衛(wèi)生條例(2005)》,中國政府報告上海和安徽發(fā)現(xiàn)3例人感染新型甲型H7N9禽流感病毒(以下簡稱H7N9)病例。在隨后的幾個月內(nèi),以華東地區(qū)為代表的我國多個省市陸續(xù)確診并報道多例H7N9禽流感病毒感染人造成重癥肺炎甚至死亡的病例,這是世界首次發(fā)現(xiàn)的新型重配H7N9禽流感病毒所致的人感染疫情,引起了廣泛關注。

H7N9禽流感病毒是由H7 的HA 基因,N9 的NA 基因以及H9N2 病毒的6 個內(nèi)部基因片段重配而成的新型病毒。對目前已公布了全基因組的若干H7N9禽流感患者分離株的序列分析結(jié)果顯示,該病毒具有與之前其他亞型甲型流感病毒類似的遺傳特征,包括對禽類低致病性,感染哺乳動物的能力增強,對金剛烷胺類抗病毒藥物耐藥,以及對神經(jīng)氨酸酶抑制劑(如奧司他韋和扎那米韋)敏感。

人感染H7N9禽流感病毒后,臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、乏力、肌肉酸痛、咯血及胃腸道癥狀,初始癥狀并不包括鼻塞和流涕。97%的患者出現(xiàn)肺炎,超過70%的患者發(fā)生急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS),部分患者繼而進展為頑固性低氧血癥和多器官功能衰竭并導致最終死亡。少數(shù)病例為輕癥,均為兒童,常常僅有發(fā)熱表現(xiàn)。實驗室檢測結(jié)果顯示,患者外周血白細胞正常或減少,淋巴細胞減少,血小板缺乏,以及肝酶輕度升高。約60%的病例具有各種并發(fā)癥,如冠心病、糖尿病、高血壓和慢性阻塞性肺病。病例以老年人(平均年齡62歲)和男性(69%)居多。

研究顯示,活禽市場是人感染H7N9 禽流感病毒的可能來源。活禽暴露是人感染的關鍵風險因素,導致患者感染的主要暴露方式為直接接觸染毒的活禽、被其排泄物污染的環(huán)境或物品。然而,目前從不同患者體內(nèi)分離到的病毒株基因組序列存在一定的差異,其進化源頭似乎并不相同,因此目前報道的這些病例極有可能是一些獨立的感染事件。流行病學調(diào)查也為這一論點提供了部分佐證。目前已確診的人感染病例多為散發(fā),彼此間沒有明顯的流行病學關聯(lián)。盡管如此,目前仍有三起疑似家庭聚集案例的報道。

基因進化分析顯示,H7N9 禽流感病毒是一種新型重配病毒。雖然各基因片段分別與近期東亞地區(qū)流行的禽流感病毒同源性較高,但這種基因組成之前從未在禽、人或其他動物中發(fā)現(xiàn)過。其HA 基因可能源于我國長三角地區(qū)鴨群中的H7 亞型禽流感病毒,NA基因的來源目前尚無定論,早期研究認為其源于歐亞遷徙的候鳥,最新研究則指出它與2010-2011年間途徑香港境內(nèi)的候鳥分離到的H11N9和H2N9病毒高度同源。盡管如此,目前無異議的一致的結(jié)論是,野鳥在H7N9 禽流感病毒傳播中可能扮演重要角色,鴨群則在將H7N9相關病毒從野鳥傳至家禽的過程中,起到至關重要的中間宿主作用。

模型信息

中文名稱:H7N9氣溶膠吸入感染雪貂模型

英文名稱:A/Anhui/1/2013 (H7N9) aerosol route infected ferret model

類型:流感動物模型

分級:NA

用途:用于H7N9 禽流感研究。

研制單位:中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所

保存單位:中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所

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